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引言

隨著抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物（AOCs）從概念驗(yàn)證加速進(jìn)入臨床開發(fā)階段，建立與之匹配的、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制體系并深刻理解其面臨的臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)，已成為推動該領(lǐng)域成熟的關(guān)鍵。AOCs作為一種由大分子抗體與化學(xué)大分子寡核苷酸通過連接子共價(jià)結(jié)合而成的復(fù)雜實(shí)體，其結(jié)構(gòu)異質(zhì)性高，生產(chǎn)過程涉及多步合成與純化。為確保最終產(chǎn)品的安全性、有效性和批次間一致性，必須建立一套從中間體到成品的全方位質(zhì)量控制策略。其質(zhì)量控制遠(yuǎn)非兩者簡單的疊加，而是需要對寡核苷酸-抗體比率（OAR）、偶聯(lián)位點(diǎn)、游離雜質(zhì)及生物活性等獨(dú)特屬性進(jìn)行多維度的精準(zhǔn)表征。

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一、AOC的制造工藝

AOC制造通常涉及裸抗體、連接子、寡核苷酸、AOC散裝溶液和AOCs的生產(chǎn)。基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)和風(fēng)險(xiǎn)評估等原則的工藝設(shè)計(jì)和開發(fā)，指導(dǎo)生產(chǎn)過程中宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和試劑的控制。應(yīng)全面管理與AOC組件制造過程相關(guān)的潛在雜質(zhì)和病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)在工藝開發(fā)層面進(jìn)行優(yōu)化，以主動實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制。

AOC生產(chǎn)材料包括制造材料、細(xì)胞基質(zhì)、耗材和容器。制造材料涵蓋起始物料、生產(chǎn)過程中使用或添加的材料、輔料和生產(chǎn)耗材。制造材料的質(zhì)量與最終產(chǎn)品的質(zhì)量、安全性和有效性密切相關(guān)，應(yīng)在穩(wěn)健和標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量管理體系內(nèi)使用風(fēng)險(xiǎn)評估原則進(jìn)行控制。例如，當(dāng)生產(chǎn)具有高疏水性的AOCs時(shí)，應(yīng)特別注意AOC分子與滅菌濾膜之間潛在的非特異性結(jié)合，因此需要仔細(xì)選擇合適的膜。

1. 單克隆抗體

單克隆抗體通常用于AOCs，mAbs的制造工藝與傳統(tǒng)抗體治療藥物的制造非常相似。然而，由于為定點(diǎn)偶聯(lián)設(shè)計(jì)的基因工程mAbs的修飾基團(tuán)，生產(chǎn)工藝可能有所不同。因此，除了常規(guī)抗體生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)因素外，還必須解決AOC制造特有的風(fēng)險(xiǎn)因素。例如，在采用賴氨酸介導(dǎo)綴合的AOCs中，應(yīng)注意裸抗體上N末端賴氨酸殘基的水平以及裸抗體溶液中的氨基酸組成。在采用半胱氨酸介導(dǎo)偶聯(lián)的AOCs中，必須監(jiān)測裸抗體中的半胱氨酸變體，如具有二硫鍵和游離硫醇基團(tuán)的半胱氨酸。在裸抗體溶液的開發(fā)過程中，應(yīng)防止抗體降解和聚集。此外，與后續(xù)偶聯(lián)工藝的兼容性將防止在AOC生產(chǎn)的后期階段（包括綴合和制劑）產(chǎn)生不利影響。

典型的抗體生產(chǎn)過程包括細(xì)胞增殖、mAb表達(dá)、mAb純化以及mAb修飾和功能化。在細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)表達(dá)過程中，應(yīng)控制關(guān)鍵的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。親和層析通常用于mAbs的初步純化。低pH處理通常用于病毒滅活；但是，如果產(chǎn)品在低pH條件下不穩(wěn)定，則可以使用替代的病毒滅活策略。中間和精制純化通常采用離子交換層析和疏水相互作用層析。使用層析方法（包括混合填充材料的層析）從蛋白質(zhì)中去除工藝相關(guān)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。大多數(shù)純化工藝還結(jié)合了納濾以去除對化學(xué)滅活具有抵抗力的小病毒。最后，通過超濾濃縮mAbs并交換緩沖液。細(xì)胞培養(yǎng)和純化后，對抗體進(jìn)行修飾以引入偶聯(lián)所需的官能團(tuán)。修飾過程根據(jù)偶聯(lián)技術(shù)而異；主要目標(biāo)是在抗體上引入反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。例如，可以使用還原劑切割二硫鍵并生成反應(yīng)性游離硫醇基團(tuán)。可以通過糖基的酶修飾引入反應(yīng)性官能團(tuán)�？贵w修飾是決定AOCs中寡核苷酸負(fù)載能力和分布的關(guān)鍵步驟。因此，必須基于特定的偶聯(lián)技術(shù)和修飾開發(fā)合適的制造工藝，并建立合理的中間過程控制策略。如果需要純化修飾后的裸抗體，則應(yīng)實(shí)施適當(dāng)?shù)募兓�工藝。如果修飾過程中使用的試劑引入了外源性病毒污染物，則必須在純化過程中去除這些污染物。應(yīng)根據(jù)國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）Q5A指南進(jìn)行病毒清除研究。如果將修飾后的裸抗體作為中間體管理，則必須建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并且必須進(jìn)行穩(wěn)定性研究以確定保質(zhì)期。對于需要定點(diǎn)綴合的AOCs，mAb修飾過程中的還原和再氧化條件尤為關(guān)鍵。抗體修飾中的關(guān)鍵工藝參數(shù)包括試劑類型、接觸時(shí)間、試劑濃度和溫度。

2. 連接子

AOCs合成中采用兩種類型的連接子。含連接子的亞磷酰胺單體和含有兩個(gè)偶聯(lián)基團(tuán)的連接子。含連接子的亞磷酰胺單體應(yīng)根據(jù)適用于治療性寡核苷酸合成中用作起始物料的單體的控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行開發(fā)和制造。含有兩個(gè)偶聯(lián)基團(tuán)的連接子可以根據(jù)適用于常規(guī)小分子活性藥物成分的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行開發(fā)。應(yīng)為連接子制造過程中使用的中間體、關(guān)鍵起始物料和試劑建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)原材料或中間體中的雜質(zhì)與最終產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性相關(guān)時(shí)，必須驗(yàn)證在制造過程中去除此類雜質(zhì)或其衍生物。如果工藝涉及過濾器的重復(fù)使用，應(yīng)注意過濾器的使用壽命和清潔方法，并進(jìn)行相關(guān)研究。對于含有手性中心的連接子，應(yīng)評估手性對AOC產(chǎn)品生物活性的影響，并適當(dāng)控制手性雜質(zhì)。連接子的關(guān)鍵質(zhì)量屬性應(yīng)通過基于其對AOC綴合工藝以及最終產(chǎn)品安全性和有效性的潛在影響的風(fēng)險(xiǎn)評估來確認(rèn)。

3. 寡核苷酸

目前寡核苷酸活性藥物成分的工業(yè)生產(chǎn)采用以單體為原料的固相合成。合成過程在固相支持物上啟動，該支持物可能預(yù)裝載有遞送配體。使用固相合成設(shè)備，通過去保護(hù)、偶聯(lián)、氧化/硫代和加帽，將核苷單體依次連接到寡核苷酸鏈的3'至5'方向。通過氨解將寡核苷酸鏈從固相支持物上切割下來，并去除保護(hù)基團(tuán)。隨后的純化、超濾和凍干（如適用）產(chǎn)生單鏈寡核苷酸中間體。然后將所得的正義鏈和反義鏈以適當(dāng)?shù)谋壤�退火（如適用）形成雙鏈寡核苷酸（如適用），隨后進(jìn)行凍干（如適用）和包裝以獲得活性寡核苷酸藥物成分。

寡核苷酸的生產(chǎn)應(yīng)根據(jù)ICH Q9-Q11中概述的原則進(jìn)行評估，特別關(guān)注固相合成過程中每個(gè)步驟的關(guān)鍵性�；�于寡核苷酸制造和質(zhì)量控制的平臺賦能模塊的可用性，應(yīng)根據(jù)先前項(xiàng)目的經(jīng)驗(yàn)和歷史批次數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評估。應(yīng)基于寡核苷酸活性藥物成分的質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況，建立將關(guān)鍵質(zhì)量屬性與關(guān)鍵工藝參數(shù)相關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)管理策略，以制定適當(dāng)?shù)闹圃旃に囐|(zhì)量控制策略。高級控制策略可能包括過程分析技術(shù)（離線、在線、在線）、由設(shè)備內(nèi)傳感器監(jiān)測的工藝參數(shù)直接通知的直接控制、生產(chǎn)線和設(shè)施中設(shè)備操作的實(shí)時(shí)控制以及數(shù)據(jù)管理和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。

4. 含連接子的寡核苷酸

AOCs的有效載荷是低細(xì)胞毒性的寡核苷酸。因此，寡核苷酸的合成和制造可以在具有標(biāo)準(zhǔn)防護(hù)設(shè)備的常規(guī)生產(chǎn)設(shè)施中進(jìn)行。通常不需要使用通風(fēng)柜動力空氣凈化呼吸器、高活性材料隔離策略和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測程序。連接子通常通過使用相容的連接子和亞磷酰胺單體進(jìn)行一步固相合成摻入寡核苷酸中。如果所需連接子的化學(xué)性質(zhì)與固相合成條件不兼容，則使用固相和液相合成以兩步法制備具有特定連接子的寡核苷酸。

5. AOC散裝溶液制備

使用各種技術(shù)平臺進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，通過快速化學(xué)或酶促反應(yīng)將寡核苷酸精確附著到修飾裸抗體上的反應(yīng)位點(diǎn)。在此過程中，必須考慮裸抗體、連接子和有效載荷物理化學(xué)性質(zhì)的差異，并嚴(yán)格優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù)。有機(jī)溶劑的類型、小分子進(jìn)料比例、pH、溫度和裸抗體濃度直接影響反應(yīng)效率，必須精細(xì)控制以最小化聚集和非特異性結(jié)合的形成。

鑒于AOCs的高度異質(zhì)性，工藝開發(fā)應(yīng)關(guān)注以下方面：（1）如果涉及還原，則選擇抗體二硫鍵還原位點(diǎn)并控制還原程度；（2）偶聯(lián)位點(diǎn)的特異性以及對綴合寡核苷酸的精確控制；（3）有效載荷分布的均勻性；（4）監(jiān)測偶聯(lián)過程中的雜質(zhì)。對于定點(diǎn)綴合，必須基于潛在機(jī)制評估脫靶綴合的風(fēng)險(xiǎn)和副反應(yīng)的發(fā)生率。對于酶促偶聯(lián)，應(yīng)驗(yàn)證與酶相關(guān)的安全風(fēng)險(xiǎn)，特別是散裝溶液中的殘留水平。

擴(kuò)大生產(chǎn)時(shí)需要特別注意兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)類別。首先，原材料投入過多可能導(dǎo)致副產(chǎn)物積累，需要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，并結(jié)合下游純化能力進(jìn)行工藝優(yōu)化。其次，必須通過逐步參數(shù)優(yōu)化和過程監(jiān)控來防止多步綴合反應(yīng)中原材料比例不平衡或反應(yīng)效率不足，例如偶聯(lián)未負(fù)載連接子的抗體比例增加、次優(yōu)OAR或殘留有效載荷過多。

偶聯(lián)后，應(yīng)從AOC反應(yīng)混合物中去除工藝相關(guān)和產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)。工藝相關(guān)雜質(zhì)包括殘留的修飾試劑（如還原劑）、催化劑、酶、有機(jī)溶劑和其他外源性物質(zhì)。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包括聚集體、抗體片段、游離小分子及其衍生物、副產(chǎn)物和其他內(nèi)源性污染物。值得注意的是，在AOC生產(chǎn)過程中，可以通過純化選擇性去除特定組分，以精細(xì)控制OAR和有效載荷分布。因此，純化技術(shù)的選擇應(yīng)以特定的純化目標(biāo)（例如雜質(zhì)清除或產(chǎn)品屬性優(yōu)化）以及對生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的雜質(zhì)類型和水平的全面評估為指導(dǎo)。應(yīng)建立有針對性的純化策略并驗(yàn)證去除效率，以確保最終產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

6. AOC制劑

AOC劑型和配方必須根據(jù)每個(gè)AOC的復(fù)雜性和獨(dú)特特性量身定制。應(yīng)進(jìn)行全面研究，以確定適當(dāng)?shù)膭┬�，防止AOCs在儲存期間在溶液中降解和聚集。

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二、AOC的質(zhì)量控制

AOCs具有抗體藥物和寡核苷酸治療藥物的屬性。鑒于AOC治療藥物獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，在建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)考慮整體AOC分子（散裝溶液和制劑）及其關(guān)鍵成分（裸抗體和寡核苷酸）。此外，質(zhì)量控制策略應(yīng)針對具體產(chǎn)品，并考慮設(shè)計(jì)原理和制造工藝。與ADCs類似，AOCs表現(xiàn)出復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、高異質(zhì)性和多種多樣的產(chǎn)品相關(guān)和工藝相關(guān)雜質(zhì)。應(yīng)根據(jù)抗體和寡核苷酸的質(zhì)量屬性以及與綴合工藝相關(guān)的因素來確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性。應(yīng)開發(fā)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和分析方法，以全面表征結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)、生物活性和雜質(zhì)。對AOC中間體、散裝溶液和制劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的研究應(yīng)基于以下章節(jié)提供的先前經(jīng)驗(yàn)。

1. 中間體

AOCs中的寡核苷酸有效載荷大于ADCs中的小分子有效載荷，導(dǎo)致分子大小和電荷發(fā)生顯著變化。ADCs中偶聯(lián)分子的特性更像抗體而非小分子。然而，AOCs中的偶聯(lián)物表現(xiàn)出雙重特性，既像帶正電荷的抗體，又像帶負(fù)電荷的寡核苷酸。例如，ADC散裝溶液放行階段的質(zhì)量控制屬性，如大小變異雜質(zhì)、電荷變異雜質(zhì)和糖基化變異雜質(zhì)，在AOC散裝溶液放行階段控制起來要困難得多。這種復(fù)雜性也適用于寡核苷酸中的核酸雜質(zhì)。寡核苷酸的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)通常包括N-1和N+1序列變異；裸抗體的引入顯著復(fù)雜化了將這些雜質(zhì)與AOCs分離的過程。因此，應(yīng)在中間體放行階段單獨(dú)控制偶聯(lián)工藝之前產(chǎn)生的雜質(zhì)。

裸抗體：評估用于AOCs的裸抗體中間體的質(zhì)量類似于評估抗體藥物；但是，應(yīng)考慮與偶聯(lián)工藝相關(guān)的質(zhì)量屬性。例如，在采用半胱氨酸介導(dǎo)綴合的AOCs生產(chǎn)中，必須仔細(xì)監(jiān)測裸抗體中半胱氨酸變體（例如具有二硫鍵和游離硫醇基團(tuán)的半胱氨酸）的水平。用于AOCs的裸抗體可能是新分子或生物類似藥，應(yīng)具有明確的基因來源和背景信息。裸抗體生產(chǎn)細(xì)胞庫的表征和穩(wěn)定性評估必須符合《中華人民共和國藥典》和ICH Q5A。此外，培養(yǎng)基和添加劑不應(yīng)存在傳染性海綿狀腦病或牛海綿狀腦病的風(fēng)險(xiǎn)�？傮w而言，可能影響最終產(chǎn)品安全性和有效性的質(zhì)量屬性應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特有的特性進(jìn)行適當(dāng)控制。工藝相關(guān)雜質(zhì)，包括宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)，應(yīng)在中間體放行階段控制，而不是在AOC散裝溶液放行階段。

寡核苷酸和含連接子的寡核苷酸：寡核苷酸生產(chǎn)通常采用固相合成。ICH Q6A明確指出，其范圍不包括放射性藥物、發(fā)酵產(chǎn)品、寡核苷酸、草藥或源自動物和植物的粗制品，或寡核苷酸治療藥物。但是，一些測試項(xiàng)目和限度仍可使用本指南作為補(bǔ)充參考進(jìn)行開發(fā)，包括外觀、鑒別、含量測定和雜質(zhì)。此外，美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局最近發(fā)布的寡核苷酸藥物草案指南也可作為參考。

除了小分子化學(xué)藥物或合成肽活性藥物成分的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量評估外，固相合成寡核苷酸藥物的質(zhì)量評估應(yīng)納入針對其獨(dú)特制造工藝、結(jié)構(gòu)特征和物理化學(xué)性質(zhì)的具體測試，包括序列驗(yàn)證和反離子含量分析。寡核苷酸中的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)多樣且結(jié)構(gòu)復(fù)雜（例如N-1、N+1、不完全去保護(hù)和P=O），需要多種正交分析方法來控制。工藝相關(guān)雜質(zhì)，包括殘留試劑和小分子污染物，通常在寡核苷酸制造過程中完全去除。此外，遺傳毒性雜質(zhì)、殘留溶劑和無機(jī)雜質(zhì)的控制策略應(yīng)與相關(guān)ICH指南保持一致。

含連接子的寡核苷酸的質(zhì)量控制取決于合成路線，可分為兩種情況。如果連接子是通過固相合成過程中使用專門的亞磷酰胺單體引入的，則可以使用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸質(zhì)量控制策略評估含連接子的中間體寡核苷酸。但是，如果連接子是通過與寡核苷酸中間體反應(yīng)引入的，則應(yīng)評估寡核苷酸和連接子偶聯(lián)的寡核苷酸中間體。應(yīng)評估含連接子的寡核苷酸在偶聯(lián)過程中引入的雜質(zhì)或反應(yīng)副產(chǎn)物。例如，用馬來酰亞胺基團(tuán)修飾的寡核苷酸通常會發(fā)生緩慢水解，導(dǎo)致產(chǎn)生非反應(yīng)性寡核苷酸-連接子副產(chǎn)物。此外，應(yīng)控制在寡核苷酸-連接子偶聯(lián)反應(yīng)中使用的溶劑等工藝相關(guān)雜質(zhì)。

與ASOs和PMOs不同，siRNA作為雙鏈寡核苷酸，需要確保siRNA在寡核苷酸連接子偶聯(lián)步驟和抗體綴合物制備步驟中的穩(wěn)定性。通常，siRNA連接子的制備在抗體偶聯(lián)物制備之前完成。策略1涉及首先制備寡核苷酸連接子偶聯(lián)物，然后與互補(bǔ)鏈雜交。策略2涉及首先制備連接子siRNA的雜交，然后將連接子與帶有連接子的siRNA偶聯(lián)。無論采用何種策略，都需要確保siRNA在工藝步驟中的穩(wěn)定性，并避免在高溫和高pH下變性。對于siRNA純度的檢測，可以使用尺寸排阻色譜法和非變性離子對反相色譜法來控制雙鏈和殘留單鏈的純度。應(yīng)過量使用不含連接子的互補(bǔ)鏈，因?yàn)樗�不會在抗體綴合物制備步驟中引入AOC儲備溶液，并且在工藝步驟中更容易去除。此外，對于偶聯(lián)過程中產(chǎn)生的寡核苷酸或寡核苷酸-連接子降解產(chǎn)物，例如由馬來酰亞胺水解形成的非反應(yīng)性連接子-寡核苷酸雜質(zhì)和反應(yīng)性寡核苷酸脫硫雜質(zhì)，一個(gè)可用的選擇是使用反相色譜法，它提供增強(qiáng)的分辨率、變性離子對或變性離子交換色譜法。

2. AOC散裝溶液

寡核苷酸-抗體比率（OAR）‍：OAR定義為每個(gè)抗體分子綴合的寡核苷酸分子數(shù)。OAR決定了AOC的分子量和大小，并與AOC的物理化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，包括溶解度、親和力和聚集。OAR直接影響產(chǎn)品的效力、安全性和藥代動力學(xué)。因此，優(yōu)化OAR可顯著提高成本效益和制造效率。OAR必須在散裝溶液制造過程中進(jìn)行控制和監(jiān)測，尤其是在偶聯(lián)過程中。用于OAR的常見分析方法包括紫外-可見光譜法、強(qiáng)陰離子交換色譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳-質(zhì)譜法、還原毛細(xì)管凝膠電泳法和尺寸排阻色譜-質(zhì)譜法。ADCs的藥物-抗體比率分析通常利用不同數(shù)量小分子有效載荷的疏水性差異。然而，對于AOCs，寡核苷酸的變化導(dǎo)致疏水性和與色譜固定相的二次相互作用差異最小。因此，使用疏水相互作用色譜法或反相液相色譜法分析AOCs的OAR具有挑戰(zhàn)性。帶負(fù)電荷的寡核苷酸通常會改變AOC分子的整體電荷。因此，可以采用能夠區(qū)分電荷差異的分析方法來分析具有不同OAR的AOCs。Tian等人首次使用毛細(xì)管區(qū)帶電泳-質(zhì)譜法來表征和量化具有不同OAR值的AOCs。優(yōu)化鞘流緩沖液和干燥氣體條件顯著提高了AOCs的電離和解吸效率，并通過調(diào)節(jié)背景電解質(zhì)的pH實(shí)現(xiàn)了具有不同OAR的AOCs的分離。Cochran等人使用還原毛細(xì)管凝膠電泳分析了抗體綴合PMOs的OAR。使用還原毛細(xì)管凝膠電泳可以分離還原的輕鏈、綴合一個(gè)PMO的輕鏈、重鏈和綴合一個(gè)至五個(gè)PMO的重鏈，顯著提高了OAR測定的準(zhǔn)確性。此外，通過尺寸排阻色譜結(jié)合質(zhì)譜分析AOCs中的OAR值與ADCs相比具有明顯優(yōu)勢。ADCs中的藥物分子通常分子量低于2 kDa。然而，寡核苷酸要大得多，通常超過10 kDa。因此，具有不同OAR值的AOCs之間的分子量差異非常明顯。利用這一優(yōu)勢，Nagornov等人采用天然尺寸排阻色譜結(jié)合Orbitrap傅里葉變換質(zhì)譜法分析了曲妥珠單抗-寡核苷酸偶聯(lián)物的完整分子和亞基的OAR分布，并計(jì)算了平均OAR。將FTMS Booster X2數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)與Q Exactive HF Orbitrap儀器用于傅里葉變換質(zhì)譜，實(shí)現(xiàn)了簡化的數(shù)據(jù)采集和處理。因此，在OAR分析之前不再需要純化和去糖基化步驟，簡化了藥物開發(fā)流程。值得注意的是，基于質(zhì)譜的方法往往會低估OAR，因?yàn)楣押塑账岬呢?fù)電荷會顯著降低正離子模式下高OAR分子的信號。因此，應(yīng)使用正交技術(shù)（如強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法）補(bǔ)充基于質(zhì)譜的OAR測定。

偶聯(lián)位點(diǎn)分布和未偶聯(lián)mAbs：AOCs的異質(zhì)性反映在偶聯(lián)寡核苷酸數(shù)量的變化和偶聯(lián)的特定位點(diǎn)上，這會影響其效力和安全性。當(dāng)前的AOC偶聯(lián)策略，不包括離子相互作用和競爭性親和力（例如生物素標(biāo)記的寡核苷酸與抗體上親和素之間的強(qiáng)相互作用），通常涉及通過賴氨酸或半胱氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，從而導(dǎo)致產(chǎn)品異質(zhì)性。應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ǎ�包括離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、毛細(xì)管電泳法和質(zhì)譜法，來表征具有不同OAR的AOCs上的寡核苷酸分布。蛋白質(zhì)工程和酶方法已成功應(yīng)用于生產(chǎn)具有改善均一性和定點(diǎn)AOCs，這可能會減少綴合位點(diǎn)異質(zhì)性帶來的挑戰(zhàn)。

以ADCs為例，液相色譜-質(zhì)譜法是分析綴合位點(diǎn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，因其高靈敏度、高分辨率和位點(diǎn)特異性分析。然而，使用這種方法分析AOCs中的偶聯(lián)位點(diǎn)具有挑戰(zhàn)性。寡核苷酸相對較大的分子量和負(fù)電荷會顯著改變抗體的電荷，并可能主導(dǎo)AOC的凈電荷。這些差異影響了檢測模式（正離子或負(fù)離子模式）的選擇，并增加了串聯(lián)質(zhì)譜中離子碎裂的難度，阻礙了偶聯(lián)位點(diǎn)的準(zhǔn)確識別。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，應(yīng)引入樣品制備步驟，去除寡核苷酸部分，以提高偶聯(lián)水平的定量準(zhǔn)確性和離子碎裂質(zhì)量。去除寡核苷酸部分的常用方法包括酶消化（例如使用核酸酶P1或磷酸二酯酶I）將寡核苷酸消化成短核苷酸序列甚至單個(gè)核苷酸。酶消化對天然寡核苷酸和化學(xué)修飾的寡核苷酸都有效。該策略已成功應(yīng)用于ADCs中偶聯(lián)位點(diǎn)的識別和定量，顯著提高了綴合位點(diǎn)的識別率和綴合水平的定量準(zhǔn)確性。

對于非偶聯(lián)抗體，使用強(qiáng)陰離子交換色譜法或尺寸排阻色譜法進(jìn)行質(zhì)量控制。在強(qiáng)陰離子交換中，通過帶負(fù)電荷的分析物與固定相中帶正電荷的季銨基團(tuán)之間的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)保留。保留強(qiáng)度由目標(biāo)分子上的負(fù)電荷決定。典型的洗脫順序如下：非偶聯(lián)抗體、具有不同OAR的AOCs（較高OAR洗脫較晚）和游離寡核苷酸。大多數(shù)非偶聯(lián)抗體不攜帶負(fù)電荷。因此，它們傾向于不保留地流過，與其他組分（如AOCs）分離。然而，確保反應(yīng)溶液和儲存緩沖液在檢測波長處沒有特征吸收至關(guān)重要，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致高估。值得注意的是，強(qiáng)陰離子交換色譜法不適用于中性電荷的寡核苷酸有效載荷（如PMOs）；因此，應(yīng)采用替代分析方法來分析這些有效載荷�；�于尺寸排阻色譜的分離機(jī)制，洗脫順序通常如下：具有不同OAR的AOCs（較高OAR洗脫較早）、非偶聯(lián)抗體和游離寡核苷酸。尺寸排阻色譜法也可用于檢測分子量與其他組分顯著不同的非偶聯(lián)抗體。偶聯(lián)位點(diǎn)分布和非偶聯(lián)mAbs的分析可以與OAR相關(guān)聯(lián)，以提高產(chǎn)品質(zhì)量控制的全面性。

生物活性：生物活性是產(chǎn)品質(zhì)量和效力的關(guān)鍵指標(biāo)。對于AOCs，應(yīng)建立生物活性測定以反映體內(nèi)藥效學(xué)機(jī)制。這些測定是評估產(chǎn)品功能活性的基礎(chǔ)。AOCs中的抗體與靶抗原結(jié)合，隨后AOC-受體復(fù)合物內(nèi)在化形成內(nèi)體。連接子的裂解促進(jìn)寡核苷酸從內(nèi)體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在那里發(fā)揮其生物效應(yīng)。應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ǎ�包括表面等離子體共振和酶聯(lián)免疫吸附測定，來評估AOC與靶抗原的結(jié)合。應(yīng)開發(fā)使用表達(dá)靶抗原的細(xì)胞系的基于細(xì)胞的測定來分析生物活性�？梢愿鶕�(jù)評估靶細(xì)胞中小核酸藥物效力的方法來評估AOC治療藥物的體外效力。應(yīng)評估靶mRNAs、蛋白質(zhì)、細(xì)胞表型和功能干擾。在選擇生物活性測定時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮變異性低、操作簡單、可有效評估和質(zhì)量控制的測定。

游離寡核苷酸：未與抗體偶聯(lián)的寡核苷酸以多種形式存在，包括游離寡核苷酸和寡核苷酸-連接子復(fù)合物。游離寡核苷酸的毒性源于由于堿基互補(bǔ)配對而產(chǎn)生的雜交依賴性毒性；與雜交無關(guān)的毒性與其化學(xué)修飾、物理化學(xué)性質(zhì)和遞送載體有關(guān)。這些毒性可能導(dǎo)致血小板減少癥、凝血抑制以及高暴露水平器官的毒性作用。可以通過基于其毒性和清除率建立適當(dāng)?shù)南薅葋砜刂朴坞x寡核苷酸。此外，在穩(wěn)定性研究期間，應(yīng)注意有效載荷脫落的風(fēng)險(xiǎn)，這可以通過使用強(qiáng)陰離子交換色譜法和尺寸排阻色譜法監(jiān)測AOC產(chǎn)品中游離寡核苷酸的水平來評估。

其他關(guān)鍵質(zhì)量屬性：

AOC和蛋白質(zhì)濃度：應(yīng)采用適當(dāng)?shù)奈锢�、化學(xué)或免疫學(xué)方法來量化AOC產(chǎn)品。當(dāng)使用分光光度法進(jìn)行濃度測量時(shí)，必須考慮寡核苷酸在測量波長處對吸光度的潛在貢獻(xiàn)。寡核苷酸在260 nm處表現(xiàn)出最大吸收，在計(jì)算AOC散裝溶液或制劑的濃度時(shí)通常需要適當(dāng)?shù)男Ｕ�因子。Cochran等人使用280 nm處的吸光度和藥物-抗體比率1和2的消光系數(shù)確定了AOC濃度。蛋白質(zhì)濃度也可以使用BCA測定等方法測量。評估裸抗體中間體、散裝溶液和制劑的蛋白質(zhì)含量，以確保產(chǎn)品穩(wěn)定性和效率。

產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：AOC散裝溶液中的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包括由物理化學(xué)異質(zhì)性產(chǎn)生的分子變異。應(yīng)分離、識別和分析目標(biāo)產(chǎn)物的分子變異。常見的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包括電荷變異、分子大小變異和降解產(chǎn)物。例如，在使用馬來酰亞胺試劑修飾抗體期間，可能通過與鄰近賴氨酸殘基的反應(yīng)形成非特異性分子內(nèi)交聯(lián)副產(chǎn)物。表現(xiàn)出與目標(biāo)產(chǎn)品等效活性的變異包括產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)。

對于在散裝溶液生產(chǎn)或儲存過程中由AOC降解產(chǎn)生的裸抗體或寡核苷酸雜質(zhì)，應(yīng)利用適當(dāng)?shù)念A(yù)處理策略來最小化或消除分析此類雜質(zhì)相關(guān)的挑戰(zhàn)。例如，可以對AOC進(jìn)行蛋白水解消化以分析siRNA或ASO，并應(yīng)用寡核苷酸的磷酸二酯酶消化來分析抗體。這些策略涉及可能對產(chǎn)品質(zhì)量分析構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)的樣品預(yù)處理步驟。因此，必須系統(tǒng)評估預(yù)處理對產(chǎn)品的影響，以避免將預(yù)處理引入的雜質(zhì)誤判為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)或高估其水平。

工藝相關(guān)雜質(zhì)：工藝相關(guān)雜質(zhì)是在制造過程中引入的，包括由抗體和連接子綴合的寡核苷酸之間反應(yīng)產(chǎn)生的雜質(zhì)。這些雜質(zhì)包括酶、有機(jī)試劑和元素雜質(zhì)。應(yīng)對這些雜質(zhì)的殘留水平進(jìn)行徹底的安全風(fēng)險(xiǎn)評估，并應(yīng)將具有潛在安全風(fēng)險(xiǎn)的殘留雜質(zhì)納入質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3. 成品AOC產(chǎn)品

對于成品AOC產(chǎn)品的質(zhì)量控制，應(yīng)遵循藥典標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)考慮具體產(chǎn)品類型和劑型�？刂茀�數(shù)通常包括外觀、pH、滲透壓、可見異物、不溶性微粒、灌裝體積和輔料含量。對于凍干形式，應(yīng)控制復(fù)溶時(shí)間和水分含量。值得注意的是，化學(xué)修飾的寡核苷酸在儲存過程中可能產(chǎn)生內(nèi)源性可見顆粒。此外，抗體和寡核苷酸可以形成非共價(jià)復(fù)合物作為副產(chǎn)物，可能會沉淀。這些風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)在AOC制劑開發(fā)過程中仔細(xì)考慮，并實(shí)施主動監(jiān)測策略。此外，應(yīng)評估源自起始物料、散裝溶液、中間體以及與產(chǎn)品接觸的材料或設(shè)備的可提取物的風(fēng)險(xiǎn)。檢測到的可提取物應(yīng)根據(jù)ICH Q3E進(jìn)行安全評估，以防止對產(chǎn)品安全產(chǎn)生任何不利影響。

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結(jié)語

總而言之，AOCs的制造與質(zhì)量控制是一個(gè)多學(xué)科交叉的復(fù)雜系統(tǒng)工程。從抗體的工程化改造、連接子的理性設(shè)計(jì)、寡核苷酸的化學(xué)合成，到最終的偶聯(lián)、純化及制劑，每一步都需要精細(xì)的工藝優(yōu)化和嚴(yán)格的過程監(jiān)控。建立穩(wěn)健、可放大的生產(chǎn)工藝，并輔以能夠全面表征其復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的質(zhì)量控制方法，是AOC藥物成功實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化和商業(yè)化生產(chǎn)的基石。隨著行業(yè)經(jīng)驗(yàn)的積累和監(jiān)管科學(xué)的進(jìn)步，標(biāo)準(zhǔn)化的AOC生產(chǎn)與質(zhì)控指南將應(yīng)運(yùn)而生，進(jìn)一步推動這一新興治療平臺的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

Advances in the pharmaceutical development of antibody-oligonucleotide conjugates. 

Eur J Pharm Sci. 2025 Dec 1:215:107292.

       原文標(biāo)題 : AOC的工藝制造與質(zhì)量控制